Técnicas de microscopía
CONOCIMIENTOS
TÉCNICAS DE MICROSCOPÍA
Técnicas de microscopía óptica, electrónica y digital para el análisis detallado de muestras.
PRINCIPIO DE LA MICROSCOPÍA
Principio de funcionamiento:
-La microscopía consiste en obtener una imagen ampliada, en la que pueden resolverse estructuras que no podrían resolverse con la ayuda de un ojo sin ayuda.
-En el tipo de iluminación hay lentes colectoras ajustables delante de la fuente de luz.
-La formación de la imagen se produce en dos etapas, la primera la forma el objetivo. Es real, invertida y aumentada.
Poder Resolutivo:
-El aumento útil del microscopio está limitado por su poder de resolución.
-El poder de resolución está limitado por la longitud de onda del haz luminoso
-La resolución viene determinada por ciertos parámetros físicos como la longitud de onda de la luz y la potencia de generación de luz del objetivo y la lente condensadora.
Apertura numérica (NA):
– La apertura numérica de una lente es la relación entre el diámetro de la lente y su distancia focal.
-NA de una lente es un índice del poder de resolución
-NA puede disminuirse disminuyendo la cantidad de luz que pasa a través de una lente.
Límite de resolución:
-Es la distancia mínima entre dos puntos para identificarlos por separado. El límite de resolución es inversamente proporcional a la potencia o resolución. Si la longitud de onda es menor, la resolución será mayor.
-Distancia de trabajo: Es la distancia entre el objetivo y la corredera del objetivo.
-La distancia de trabajo disminuye al aumentar el aumento
-Aumento: Es la relación entre el tamaño de un objeto visto al microscopio y el tamaño real observado a simple vista.
Brillo de la imagen
-donde NA es la apertura numérica del objetivo y M es el aumento. La relación dada en la ecuación anterior expresa el poder de captación de luz del objetivo en iluminación trans.
-La intensidad de la iluminación depende del cuadrado de la apertura numérica del condensador y del cuadrado de la ampliación de la imagen de la fuente luminosa.
-El resultado es que el brillo de la imagen del espécimen es directamente proporcional al cuadrado de la apertura numérica del objetivo cuando llega al ocular o al sistema de la cámara.
-Por tanto, al examinar muestras con luz transmitida, cambiar el objetivo sin alterar el condensador afecta al brillo de la imagen en respuesta a los cambios de NA y aumento.
TIPOS DE MICROSCOPÍA
Microscopios Clasificación:
-Diferentes tipos de microscopios y a continuación puedes encontrar 4 de ellos:
-Microscopios ópticos (invertidos, verticales)
-Microscopios estereoscópicos
-Microscopios confocales
-Microscopios de electrones
Microscopio óptico:
1.Los microscopios ópticos son los más sencillos de todos los microscopios.
2.Utilizan lentes para curvar y enfocar los rayos de luz y producir imágenes ampliadas de los objetos pequeños.
3.Los microscopios ópticos se utilizan para ver muestras que no se pueden ver a simple vista. El aumento de un microscopio suele ser de 40x, 100x, 400x y a veces 1000x.
4. Los microscopios invertidos se utilizan para examinar piezas grandes a gran aumento en busca de fracturas o defectos. Una diferencia fundamental es que las muestras se colocan con el lado liso y las muestras deben prepararse para que puedan colocarse planas en la platina.
Microscopios estereoscópicos
1.Los microscopios estereoscópicos se utilizan para observar una variedad de muestras que podrías sostener en la mano.
2.Un microscopio estereoscópico proporciona una imagen tridimensional y suele proporcionar un aumento de entre 10x-40x
3.Proporciona iluminación transmitida y reflejada y puede utilizarse para observar una muestra que no permite el paso de la luz.
4.Entre los usos de este tipo de microscopio se incluyen la observación de superficies, la fabricación de relojes y la inspección de placas de circuitos, etc.
Microscopios confocales de barrido láser
1.A diferencia de los microscopios estereoscópicos y de luz, que utilizan luz normal para la formación de imágenes, el confocal utiliza una luz láser para escanear muestras que se han teñido
2.. El haz tiene una longitud de onda excepcionalmente corta, golpea la mayoría de los objetos que encuentra en su camino y aumenta significativamente la resolución del microscopio. Estas muestras se preparan en portaobjetos y se insertan, con la ayuda de ta espejo dicromático, los dispositivos producen una imagen ampliada en una pantalla de ordenador.
3.Los operadores pueden crear también imágenes en 3D, ensamblando múltiples escaneos.
4.Su resolución es mejor que la de los microscopios ópticos y se utilizan habitualmente en biología celular+ aplicación médica.
MÉTODOS DE CONTRASTE
Campo claro (BF)
-Es la forma más elemental de las técnicas de iluminación de microscopios y se utiliza generalmente con microscopios ópticos.
-El nombre deriva del hecho de que la muestra es oscura y contrasta con el campo de visión brillante que la rodea.
-El microscopio debe tener una fuente de luz que pueda proporcionar la iluminación intensa necesaria a grandes aumentos y niveles de luz más bajos para aumentos menores.
-Algunas muestras pueden verse sin tinción y la óptica utilizada en la técnica bf no altera el color de la muestra.
Campo oscuro (DF)
-La trayectoria de la luz para la iluminación DF pasa a través de un anillo hueco exterior del objetivo, incide sobre la muestra con un ángulo de incidencia elevado, se refleja en la superficie, luego pasa por el interior de la lente del objetivo y, finalmente, llega al ocular o a la cámara
-Para las muestras que tienen una superficie plana con características no planas ocasionales (grietas, poros, límites de grano grabados, etc.)
-La imagen DF muestra un fondo oscuro con zonas más brillantes correspondientes a las características no planas, que dispersan más luz en el objetivo.
Contraste de fase
-El principio básico para hacer visibles los cambios de fase en el contraste de fase consiste en separar la luz que ilumina de la luz que dispersa la muestra y manipularlas de forma diferente.
– Parte de la luz que ilumina es dispersada por la muestra con diferentes colores (verde, amarillo y rojo) Al observar una muestra sin teñir, la luz dispersada es débil y suele estar desfasada en un ángulo de -90.
– El fondo tiene casi la misma intensidad, lo que da lugar a un bajo contraste de la imagen.
-La luz también puede describirse como una vibración electromagnética que se desplaza hacia el exterior desde la fuente de su propagación, de forma muy similar a la vibración a lo largo de una cuerda.
Microestructura del aluminio puro
a)Área brillante
b)Luz polarizada
Contraste de Interferencia Diferencial (DIC)
-En esta compleja forma de microscopía de luz polarizada se utilizan dos haces de luz ligeramente separados, polarizados en el plano, para crear una imagen similar a la 3D con tonos de gris.
-Hay que tener cuidado al interpretar las imágenes DIC, ya que las colinas y valles aparentes de las muestras pueden inducir a error.
-La altura de una colina es el producto del grosor real del elemento y de su índice de refracción.
-Las variaciones de los sistemas DIC reciben el nombre de sus originarios, Nomarski y de Senarmont. Se pueden seleccionar opciones para maximizar la resolución o el contraste.
Contraste de Interferencia Diferencial (DIC)
Campo claro (BF)
Campo Oscuro (DF)
Campo claro Oblicuo
Campo de luz polarizada (PBF)
Campo brillante polarizado λ-placa
Contraste de Interfaz Diferente (DIC)
CONSIGUE TU GUÍA DE MICROSCOPÍA
Descubre todo lo que necesitas saber sobre la Microscopía con nuestro completo folleto.
