Mikroskopie-Techniken
WISSEN
MIKROSKOPIE-TECHNIKEN
Optische, elektronische und digitale Mikroskopietechniken für die detaillierte Probenanalyse.
PRINZIP DER MIKROSKOPIE
Funktionsprinzip:
• Ziel der Mikroskopie ist es, ein vergrößertes Bild zu erhalten, in dem Strukturen aufgelöst werden können, die mit dem bloßen Auge nicht erkennbar sind.
• Bei der Beleuchtungsart befinden sich verstellbare Kollektorlinsen vor der Lichtquelle.
• Die Bildentstehung erfolgt in zwei Stufen: Zunächst erzeugt das Objektiv ein reelles, invertiertes und vergrößertes Bild.
Auflösungsvermögen
• Die nutzbare Vergrößerung eines Mikroskops wird durch sein Auflösungsvermögen begrenzt.
• Das Auflösungsvermögen ist durch die Wellenlänge des verwendeten Beleuchtungsstrahls limitiert.
• Die Auflösung wird durch bestimmte physikalische Parameter bestimmt, wie die Wellenlänge des Lichts sowie die Lichtsammeleigenschaften von Objektiv- und Kondensorlinse.
Numerische Apertur (NA):
• Die numerische Apertur eines Objektivs ist das Verhältnis des Durchmessers der Objektivs zu ihrer Brennweite.
• Die NA eines Objektivs ist ein Maß für ihr Auflösungsvermögen.
• Die NA kann verringert werden, indem die durch die Linse tretende Lichtmenge reduziert wird.
Auflösungsgrenze:
• Sie ist der minimale Abstand zwischen zwei Punkten, bei dem diese noch als getrennt erkennbar sind. Die Auflösungsgrenze ist umgekehrt proportional zur Auflösung: Je kürzer die Wellenlänge, desto höher die Auflösung.
• Arbeitsabstand: Der Abstand zwischen dem Objektiv und dem Präparat.
• Der Arbeitsabstand nimmt mit steigender Vergrößerung ab.
• Vergrößerung: Das Verhältnis der Bildgröße eines Objekts im Mikroskop zur tatsächlichen Größe, wie sie mit dem bloßen Auge wahrgenommen wird.
Bildhelligkeit
• NA bezeichnet die numerische Apertur des Objektivs, M die Vergrößerung. Das in der obigen Gleichung dargestellte Verhältnis beschreibt das Lichtsammelvermögen des Objektivs bei Durchlicht.
• Die Intensität der Beleuchtung hängt vom Quadrat der numerischen Apertur des Kondensors und vom Quadrat der Verkleinerung des Abbildes der Lichtquelle ab.
• Daraus folgt: Die Helligkeit des Präparatbildes ist direkt proportional zum Quadrat der numerischen Apertur des Objektivs, sobald das Licht das Okular oder das Kamerasystem erreicht.
• Beim Arbeiten im Durchlicht führt daher ein Objektivwechsel ohne Anpassung des Kondensors zu einer veränderten Bildhelligkeit in Abhängigkeit von NA und Vergrößerung.
MIKROSKOPIE-TYPEN
Mikroskope Klassifizierung:
Verschiedene Arten von Mikroskopen und unten finden Sie 4 davon:
-Lichtmikroskope (umgedreht, aufrecht)
-Stereomikroskope
-Konfokalmikroskope
-Elektronenmikroskope
Lichtmikroskop:
1. Lichtmikroskope sind die einfachsten aller Mikroskope.
2. Mit Hilfe von Linsen werden Lichtstrahlen gebeugt und fokussiert, um vergrößerte Bilder von kleinen Objekten zu erzeugen.
3. Lichtmikroskope werden verwendet, um Proben zu betrachten, die mit dem bloßen Auge nicht zu erkennen sind. Die Vergrößerung eines Mikroskops beträgt in der Regel 40x, 100x, 400x und manchmal 1000x.
4. Umkehrmikroskope werden verwendet, um große Teile bei starker Vergrößerung auf Brüche oder Fehler zu untersuchen. Ein Hauptunterschied besteht darin, dass die Proben mit der glatten Seite auf den Tisch gelegt werden und die Proben so vorbereitet werden müssen, dass sie flach auf dem Tisch liegen können.
Stereomikroskope
1. Stereomikroskope werden zur Betrachtung unterschiedlichster Proben eingesetzt, die man in der Hand halten kann.
2. Ein Stereomikroskop liefert ein 3D-Bild und bietet in der Regel eine Vergrößerung zwischen 10x und 40x.
3. Es verfügt sowohl über Durchlicht- als auch Auflichtbeleuchtung und eignet sich damit auch für Proben, die kein Licht durchlassen.
4. Typische Anwendungen sind die Untersuchung von Oberflächen wie zum Beispiel bei der Uhrenherstellung oder die Inspektion von elektronischen Leiterplatten.
Laser-Scan-Konfokalmikroskope
1. Im Gegensatz zu Stereomikroskopen und Lichtmikroskopen, die mit normalem Licht arbeiten, verwenden Konfokalmikroskope Laserlicht, um gefärbte Proben abzutasten.
2. Der Laserstrahl besitzt eine außergewöhnlich kurze Wellenlänge, trifft nahezu alle Objekte in seinem Strahlengang und steigert dadurch die Auflösung des Mikroskops erheblich. Die Proben werden auf Objektträgern präpariert und mit Hilfe eines di-chromatischen Spiegels untersucht; das Gerät erzeugt ein vergrößertes Bild auf einem Computerbildschirm.
3. Durch die Kombination mehrerer Scans können Anwender auch dreidimensionale Bilder erzeugen.
4. Ihre Auflösung ist besser als die von Lichtmikroskopen, weshalb sie häufig in der Zellbiologie und in medizinischen Anwendungen eingesetzt werden.
KONTRASTVERFAHREN
Hellfeld - HF (BF - Bright Field)
• Es ist das einfachste Beleuchtungsverfahren in der Mikroskopie und wird allgemein bei Lichtmikroskopen eingesetzt.
• Der Name leitet sich daraus ab, dass die Probe dunkel erscheint und sich kontrastreich vom hellen Hintergrund abhebt.
• Das Mikroskop sollte über eine Lichtquelle verfügen, die bei hohen Vergrößerungen eine intensive Beleuchtung ermöglicht und bei niedrigen Vergrößerungen geringere Lichtstärken bereitstellt (gut dimmbar)
• Manche Präparate können ohne Färbung betrachtet werden, da die Optik des Hellfeldverfahrens die Farben der Probe nicht verändert.
Dunkelfeld (DF)
• Beim Dunkelfeld verläuft der Lichtstrahl durch einen äußeren Hohlring des Objektivs (Ringlicht), trifft das Präparat unter einem hohen Einfallswinkel, wird an der Oberfläche reflektiert, anschließend durch das Innere des Objektivs geleitet und gelangt schließlich ins Okular oder zur Kamera.
• Geeignet für Proben mit überwiegend ebener Oberfläche, die einzelne Unebenheiten aufweisen (z. B. Risse, Poren, geätzte Korngrenzen usw.).
• Im DF-Bild erscheint der Hintergrund dunkel, während die unebenen Strukturen hell hervortreten, da sie mehr Licht in das Objektiv streuen.
Phasenkontrast
• Das Grundprinzip des Phasenkontrasts besteht darin, Phasenverschiebungen (Lichtwellen-Verlagerungen) sichtbar zu machen, indem das direkte Beleuchtungslicht vom durch die Probe gestreuten Licht getrennt und unterschiedlich behandelt wird.
• Ein Teil des Beleuchtungslichts wird von der Probe gestreut und dabei in unterschiedlichen Wellenlängen (grün, gelb, rot) verändert. Bei ungefärbten Proben ist das gestreute Licht schwach und typischerweise um etwa –90° phasenverschoben.
• Da der Hintergrund nahezu die gleiche Intensität aufweist, entsteht ohne weitere Maßnahmen ein geringer Bildkontrast.
• Licht lässt sich auch als elektromagnetische Schwingung beschreiben, die sich von der Quelle nach außen ausbreitet – ähnlich wie eine Welle entlang eines Seils.
Reines Aluminium – Mikrostruktur
a) Hellfeld (HF)
b) Polarisiertes Licht
Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)
• Bei dieser komplexen Form der polarisierten Lichtmikroskopie werden zwei leicht versetzte, linear polarisierte Lichtstrahlen genutzt, um ein scheinbar dreidimensionales Bild in Graustufen zu erzeugen.
• Bei der Interpretation von DIC-Bildern ist Vorsicht geboten, da die scheinbaren Höhen und Täler in der Probe irreführend sein können.
• Die scheinbare „Höhe“ einer Struktur ergibt sich sowohl aus ihrer tatsächlichen Dicke als auch aus ihrem Brechungsindex.
• Varianten der DIC-Technik sind nach ihren Entwicklern benannt, Nomarski und de Senarmont. Je nach Einstellung kann wahlweise die Auflösung oder der Kontrast optimiert werden.
Differentieller Interferenzkontrast (DIC)
Hellfeld (BF)
Dunkelfeld (DF)
Hellfeld Schrägbeleuchtung / Streiflicht
Polarisiertes Hellfeld (PHF)
Polarisiertes Hellfeld mit λ-Platte (PHF λ-Platte)
Differential-Interferenz-Kontrast (DIC)
MIKROSKOPIE-AUSRÜSTUNG
Mikroskope mit unterschiedlichen Vergrößerungen und Bildgebungsverfahren. Ideal zur detaillierten Untersuchung von Oberflächen und Gefügestrukturen von Werkstoffen. Es stehen verschiedene Modelle für Labor- und Industrieanwendungen zur Verfügung.
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